中华人民共和国进出口商品检验行业标准
出口食品小肠结肠炎耶尔森 SN 0174-92氏菌检验方法
代替 ZB X04 003-86
Method for detection of Yersinia enterocciitica in food for export
1 主题内容与适用范围
本标准规定了出口冷冻和生鲜的猪肉、猪舌、鸡肉、虾和虾仁中小肠结肠炎耶尔森氏菌(以下简称耶氏菌)检验方法。
本标准适用于出口冷冻和生鲜的猪肉、猪舌、鸡肉、虾和虾仁中耶氏菌检验。其他食品可参照使用。
2 样品制备及增菌培养
2.1 如为冷冻食品,应于2～5℃下不超过18h解冻。若不能及时检验,应放于-15℃保存,最多不能超过2 d。非冷冻易腐的食品应置于4℃冰箱保存,最多不得超过3d。
2.2 无菌操作称取剪碎后的样品25g(猪舌应剪取舌根、舌两侧及舌尖部肉),置于装有225mL改良的磷酸盐缓冲液的500mL广口玻璃瓶中,充分振荡(若采用均质,可将剪碎后的样品25g置于灭菌均质杯内,加入25mL已灭菌的改良磷酸盐缓冲液,以8000～10000r/min均质0.5min,再将均质好的样品置入装有200mL改良的磷酸盐缓冲液的500mL广口玻璃瓶中,充分振荡),然后于25℃培养48±2h。吸取该培养液1mL移种于预先预热到25℃的装有9mL的5g/L氢氧化钾溶液的试管中,使之充分混合0.5min。立即吸取该混合液2mL移种于 预先预热到25℃的装有8mL的改良的酵母浸汁-孟加拉红肉汤的试管中,充分混合,于25℃培养4～6h。
3 分离培养
3.1 将上述经改良的酵母浸汁-孟加拉红肉汤增菌的培养液摇匀,以直径3mm的接种环分别挑取一环划线于表面无凝固水的含吐温80的亚硫酸铋琼脂平板和含吐温80的麦康凯琼脂平板各一个,培养于25℃,含吐温80的亚硫酸铋琼脂平板培养3～4d,含吐温80的麦康凯琼脂平板培养48±2h。
3.2 观察各琼脂平板,有无典型或可疑耶氏菌菌落。
耶氏菌的菌落特征见表1： 表1 小肠结肠炎耶尔森氏菌菌落特征
平板琼脂 菌落类别 菌 落 特 征
大小,mm 表 面 透明度 高 度 颜 色 边 缘 形状
含吐
温80
的麦
康凯
琼脂 A 1～1.5 粗糙, 有多层环状皱折 不透明 枕状,中心呈乳头状凸起 淡粉红色, 菌落周围绕有毛玻璃样淡粉红色晕 不整齐 圆形
B 1～1.5 光滑、湿润 半透明 扁平落 淡粉红色, 菌周围绕有毛玻璃样淡粉红色晕 整 齐 圆形
C 1～3.0 光滑、湿润 半透明 扁 平 淡橙粉红色散射状皱折 有细微 圆形
D 1～1.5 粗糙, 有多层环状皱折 不透明 枕状、中心呈乳头状凸起 淡粉红色, 菌落周围培养基为透明淡蔷薇红色 不整齐 圆形
含吐
温80
的亚
硫酸
铋琼
脂 E 针尖～ 3.0 光 滑 不透明 扁平或凸起 菌落黑绿色或黑灰色至漆黑色,周围培养基有时有黑绿色微粒弥漫 整 齐 圆形
F 2～3 粗糙, 有多层环状皱折 不透明 扁平, 有时中心呈乳头状凸起 灰绿色, 菌落周围绕有浅灰绿色或蓝绿色毛玻璃样晕 不整齐 圆形
4 鉴定
4.1 筛选试验
4.1.1 每种琼脂平板至少应挑取两个典型或可疑菌落,分别用光滑的接种针穿刺并密布地接种于改良的克氏双糖铁琼脂各一管,于25℃培养24±2h。
4 .1.2 挑取菌落后的琼脂平板,应置于5～8℃至少保留24h,以备必要时复查。
4.1.3 按表2试验结果进行判断。
表2 改良的克氏双糖铁琼脂筛选小肠结肠炎耶尔森氏菌
改良的克氏双糖铁琼脂 初步判断
斜 面 底 层 产 气 硫化氢
A A －(＋) － 可疑小肠结肠炎耶尔森氏菌
A A ＋ ＋ 非小肠结肠炎耶尔森氏菌
A A ＋ -
K A ＋ ＋
K A － －
注：K产碱,A产酸；＋阳性反应；－阴性反应；(＋)偶见少量小气泡。
4.2 生化试验
4.2.1 刮取一满环(直径3mm)符合表 2的典型或可疑耶氏菌特性的改良克氏双糖铁琼脂斜面培养物,接种于装有1mL Rustigian氏尿素培养基(改良法)的10 mm×100 mm的试管中,手摇或于电动快速混合器上振摇5～6s,然后于25℃培养,每隔半小时观察一次,培养观察至4h。
4.2.2 将尿素酶试验阳性的改良克氏双糖铁琼脂斜面培养物按表3所列生化项目(尿素酶试验除外)进行生化试验,培养于25℃,氨基酸脱羧酶试验培养24～30h,其他生化试验阴性结果的应培养观察4d。
表3 小肠结肠炎耶尔森氏菌生化反应与血清学试验结果判定
生 化 反 应 血清学试验 结 果 判 定
尿素酶试验 鸟氨酸脱羧酶试验 赖氨酸脱羧酶试验 蔗糖试验 山梨醇试验 L-阿拉伯糖试 验 鼠李糖试验 西蒙氏枸橼酸盐试验
＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ － － "O"因子血清试验阳性 小肠结肠炎耶尔森氏菌( 典型 )
＋ ＋ － － ＋ ＋ － － "O"因子血清试验阳性
＋ - － - - ＋ - - "O"因子血清试验阳性 小肠结肠炎耶
＋ ＋ - ＋ ＋ ＋ ＋ + "O"因子血清试验阳性 尔森氏菌(非典型)
＋ ＋ - ＋ ＋ ＋ ＋ - "O"因子血清试验阳性
＋ ＋ - ＋ ＋ ＋ - ＋ "O"因子血清试验阳性
注：＋阳性反应；－阴性反应。
4.2.3 观察生化反应结果,将符合表3耶氏菌特性的,按4.3进行血清学试验；如不符合表3所列生化反应,特别是尿素酶试验阴性或赖氨酸脱羧酶试验阳性为非小肠结肠炎耶尔森氏菌。
4.3 血清学试验 在洁净的载玻片上加一滴"O"因子血清,将待试培养物混入其内,使成为均一性混 浊悬液,将玻片轻轻摇动0.5～1min,在黑色背景下观察反应。如在2min内出现比较明显的小颗粒状凝集者,即为阳性反应,反之则为阴性,另用生理盐水作对照试验,以检查有无自凝现象。
4.4 根据4.2和4.3试验结果,按照表3进行判定。
如生化反应结果完全符合表3耶氏菌特性,但与所有"O"因子血清均不发生凝集反应者,其菌落典型,镜检为革兰氏阴性、无芽胞小短杆菌,可按《Bergey氏细菌学鉴定手册》最新版扩大必要的生化试验,判定为可疑小肠结肠炎耶尔森氏菌,并送交上一级单位鉴定。
5 报告结果 5.1 报告阳性结果:"检出小肠结肠炎耶尔森氏菌"。
5.2 报告阴性结果:"未检出小肠结肠炎耶尔森氏菌"。
6 培养基
6.1 改良的磷酸盐缓冲液
磷酸氢二钠 8.23g
磷酸二氢钠(含1个结晶水) 1.20g
氯化钠 5.00g
山梨醇 10.00g
胆盐(3号) 1.50g
蒸馏水 1000mL
将前三种成分溶于水中,再加入后两种成分,溶解后调至pH7.6,分装于500mL广口玻璃瓶内,每瓶225mL,高压灭菌121℃15min。
6.2 改良的酵母浸汁-孟加拉红肉汤(modified yeast extract-rose bengal broth)
6.2.1 基础液
磷酸二氢钾 0.508g
磷酸氢二钠 11.21g
酵母浸汁 5.00g
氯化钠 1.00g
硫酸镁(含7个结晶水) 0.01g
蒸馏水 770mL
将上述各成分溶于蒸馏水中,加热使之完全溶解,调至pH8.0,121℃高压灭菌15min。
6.2.2 40 g/L山梨糖水溶液：100.00 mL。
6.2.3 10 g/L丙酮酸钠水溶液：100.00mL。
6.2.4 4g/L孟加拉红水溶液：10.00 mL。
6.2.2, 6.2.3溶液流通蒸汽加热0.5h灭菌,6.2.4溶液过滤除菌,将灭菌过的此三种溶液加到灭菌、冷却的基础液中,调至最终pH为8.0,以无菌操作分装于18mm×180mm灭菌的试管中,每管8mL,4℃冰箱保存备用。
6.3 含吐温80的麦康凯琼脂
蛋白胨 12.00g
(月示)蛋白胨(proteose peptone) 3.00g
乳糖 10.00g
胆盐(3号) 1.50g
氯化钠 5.00g
吐温80(Tween 80) 10.00g
氯化钙(无水) 0.20g
中性红 0.03g
结晶紫 0.001g
琼脂 18.00g
蒸馏水 1000mL
将琼脂于800mL蒸馏水中加热溶化,以50mL蒸馏水将吐温80稀释,再将其他各成分(指示剂除外)加入150mL蒸馏水中,加热使之完全溶解。将后二种溶液加至已溶化的琼脂液中,充分混匀,调至pH7.1±0.2,再加入指示剂,混匀后121℃高压灭菌15min,待冷至50～ 55℃时,立即倾注于灭菌平皿内,每皿约15 mL,制成的琼脂平板呈淡橙色。
6.4 含吐温80的亚硫酸铋琼脂
6.4.1 基础液
牛肉膏 5.00g
蛋白胨 10.00g
葡萄糖 5.00g
氯化钠 5.00g
吐温8O(Tween 80) 10.00g
氯化钙(无水) 0.20g
琼脂 20.00g
蒸馏水 1000mL
6.4.2 亚硫酸铋混合液
6.4.2.1 溶解200 g无水亚硫酸钠于1000 mL蒸馏水中,配成200 g/L水溶液。
6.4.2.2 溶解50 g枸橼酸铋铵于500 mL蒸馏水中,配成100g/L水溶液,加1mL浓的氢氧化铵,放置至澄
