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实验室质量管理是什么

2014/11/27 16:16:00 来源:网友
随着现代医学及相关科学技术的发展,各学科相互交叉和渗透,医学微生物学检验技术已深入到细胞、分子和基因水平,许多新技术、新方法已在临床微生物实验室得到广泛应用。医学微生物学实验室的基本任务之一是利用微生物学检验技术,准确、快速检验和鉴定临床标本中的微生物,并对引起感染的微生物进行耐药性监测,为临床对感染性疾病诊断、治疗、流行病学调查及研究等提供科学依据。



第一节 微生物形态学检查
细菌形态学检查是细菌检验的重要方法之一,它是细菌分类和鉴定的基础,可根据其形态、结构和染色反应性等,为进一步鉴定提供参考依据。
一、显微镜检查
由于细菌个体微小,肉眼不能看到,必须借助显微镜的放大才能看到。一般形态和结构可用光学显微镜观察,其内部的超微结构则需用电子显微镜才能看清楚。常用显微镜有如下几种。
1.普通光学显微镜
  采用自然光或灯光为光源,其波长约为0.4μm。显微镜的分辨率为波长的二分之一,即0.2μm,而肉眼可见的最小形象为0.2mm。故用油(浸)镜放大1 000倍,能将0.2μm的微粒放大成肉眼可见的0.2mm。普通光学显微镜可用于细菌、放线菌和真菌等的观察。
2.暗视野显微镜
常用于观察不染色微生物形态和运动。在普通显微镜安装暗视野聚光器后,光线不能从中间直接透入,视野呈暗色,当标本接受从聚光器边缘斜射光后可发生散射,因此可在暗视野背景下观察到光亮的微生物如细菌或螺旋体等。
3.相差显微镜
相差显微镜利用相差板的光珊作用,改变直射光的光位相和振幅,将光相的差异转换为光强度差。在相差显微镜下,当光线透过不染色标本时,由于标本不同部位的密度不一致而引起光相的差异,可观察到微生物形态、内部结构和运动方式等。
4.荧光显微镜
荧光显微镜与普通光学显微镜基本相同,主要区别在于光源、滤光片和聚光器。目前大多数使用的是落射光装置,常用高压汞灯作为光源,可发出紫外光或蓝紫光。滤光片有激发滤光片和吸收滤光片二种。用蓝光的荧光显微镜除可用一般明视野聚光器外,也可用暗视野聚光器,以加强荧光与背景的对比。本法适用于对荧光色素染色或与荧光抗体结合的细菌的检测或鉴定。
5.电子显微镜
用电子流作为光源,波长与可见光相比差几万倍,大大提高了分辨力,并用磁性电圈作为光学放大系统,放大倍数可达数万倍或几十万倍,常用于病毒颗粒和细菌超微结构的观察。
二、不染色标本检查
不染色标本一般可用于观察细菌形态、动力及运动情况。细菌未染色时无色透明,在显微镜下主要靠细菌的折光率与周围环境的不同来进行观察。有鞭毛的细菌运动活泼,无鞭毛的细菌则呈不规则布朗运动。梅毒苍白密螺旋体、钩端螺旋体、弯曲杆菌等的活菌各有特征鲜明的形态和运动方式,具有诊断意义。常用的方法有压滴法、悬滴法和毛细管法等。
1.悬滴法
在洁净凹玻片的凹孔四周涂上凡士林,用接种环取一环菌悬液放在盖玻片中央,再将凹玻片的凹孔对准盖玻片中央的液滴并盖上,然后迅速翻转,轻压盖玻片,使其与凹孔边缘的凡士林粘紧封闭后置高倍镜下(或暗视野)观察。
2.压滴法
用接种环取一环菌悬液置于洁净玻片的中央,在菌悬液上轻轻盖上一盖玻片,注意避免产生气泡并防止菌悬液外溢,静止数秒钟后置高倍镜下明视野(或暗视野)观察。
3.毛细管法
主要用于厌养菌动力的检查。通常选用60~70mm长。0.5~1.0mm孔径的毛细管虹吸厌养菌悬液后,用火焰将毛细管两端熔封。并用塑胶纸将毛细管固定在载玻片上,置高倍镜下暗视野观察。

三、染色标本检查
细菌标本经染色后,由于细菌与周围环境间在颜色上形成鲜明对比,故在普通光学显微镜下可清楚地观察到细菌的形态特征(如细菌的大小、形状、排列等)和某些特殊结构(如荚膜、鞭毛、芽孢等),并可根据染色反应性对细菌加以分类鉴定。
(一)细菌染色的一般程序
细菌染色的一般程序是:涂片(干燥)—固定—染色(媒染)—(脱色)—(复染)。
1.涂片制备
血液、分泌物、排泄物、穿刺液和液体培养物,直接在载玻片上作薄膜涂片;尸检或感染动物组织,病变局部涂抹采样的棉拭子直接涂片。固体培养基上的菌落或菌苔的制片,先用接种环取一环生理盐水置载玻片中央,再用无菌接种环取少量的培养物在生理盐水中磨匀,涂布成1cm2大小的涂面,置室温下自然干燥或远火慢慢烘干。
2.固定
目的是杀死细菌,凝固细菌蛋白及结构,便于染色;促使细菌粘附在载玻片上,避免在水洗过程中被水冲掉;改变细菌对染料的通透性,有利于菌细胞内结构的染色。通常用火焰加热固定,将已干燥的涂片在火焰中迅速通过3次,以手背皮肤接触玻片不烫为佳。
3.染色
根据检验目的不同,选择不同的染色方法进行染色。染色时滴加染液,以复盖标本为度。
4.媒染
凡能增强染料和被染物的亲和力,使染料固定于被染物及能引起细胞膜通透性改变的物质,称媒染剂。常用的有明矾、鞣酸、金属盐和碘等,也有用加热法促进着色。媒染剂可用于初染与复染之间,也可用于固定之后或含于固定液、染色中。
5.脱色
凡能使已着色的被染物脱去颜色的化学试剂称为脱色剂。常用乙醇、丙酮等作为脱色剂。脱色剂可以查出细菌与染料结合的稳定程度,作为鉴别染色之用。
6.复染
已脱色处理的细菌或其结构常以复染液作复染以便于观察。复染液与初染液的颜色不同而成一鲜明对比。复染不宜太强,以免掩盖初染的颜色。

(二)常用染色法(染液配方见第8章)
单染色法
只用一种染料染色。由于大多数细菌胞浆内含有酸性物质,可与碱性染料结合,故常用吕氏美蓝、结晶紫和稀释石碳酸复红等染液。此法可观察细菌的大小、形态与排列,不能显示细菌的结构与染色特性。
2.复染色法
用两种或两种以上不同染料可将细菌染成不同的颜色,除可观察细菌的大小、形态与排列外,还反应出细菌染色特性,具有鉴别细菌种类的价值。常用的有革兰染色法和抗酸染色法。
(1)革兰染色:①细菌涂片经火焰固定,加结晶紫染液染1min,清水冲去染液。②加碘液媒染 1min,水洗,甩干。③用95%乙醇脱色,轻轻摇动约30s,至无紫色洗落为止,水洗,甩干。④加稀释石碳酸复红或沙黄染液数滴进行复染,约30s,水洗。⑤干后显微镜下镜检观察结果,革兰阳性菌染成紫色,革兰阴性菌为红色。
(2)抗酸染色:萋-尼 (Ziehl-Neelse)抗酸染色法:①细菌涂片经火焰固定,加石炭酸复红溶液,徐徐加热至有蒸气出现,切不可沸腾。染液因蒸发减少时,应随时补充,防止染液蒸干。持续染5min(奴卡菌需要加长时间),水洗,甩干。②滴加3%盐酸乙醇脱色,不时摇动玻片至无红色脱落为止,水洗,甩干。③加吕氏美蓝复染液数滴复染1min,水洗。④干后显微镜下镜检观察结果,抗酸杆菌染成红色,非抗酸杆菌为蓝色。
金胺O-罗丹明B染色法:①细菌涂片固定后加第1液30~90s。②弃去第1液后加第2液染15min。③用第3液脱色1~2min,水洗。④滴加第4液染30s,水洗,⑤干后置荧光显微镜下镜检观察结果  在淡蓝色背景下,抗酸杆菌呈红色,其它细菌和细胞呈蓝色。
3.特殊染色法
(1)鞭毛染色(改良Ryu法):①玻片的处理  将新载玻片浸泡在95%乙醇中。临用时取出,以干净纱布擦干。②在玻片上滴蒸馏水1滴。③挑取培养物少许,轻触蒸馏水滴顶部,仅允许极少量细菌进入水滴,不可搅动,以免鞭毛脱落。④置35℃孵箱自然干燥,不能用火焰固定,滴加鞭毛染液染1~2 min轻轻水洗。⑤干后显微镜镜检观察结果  鞭毛和菌体呈紫色。
(2)异染颗粒染色(阿尔培托法):①细菌涂片经火焰固定,加甲液染色3~5min。水洗。②滴加乙液,染1min。水洗。③干后显微镜镜检观察结果  菌体呈绿色,异染颗粒呈蓝黑色,用于白喉棒状杆菌染色。
(3)荚膜染色:①奥尔特荚膜染色法:将已固定的细菌涂片滴加3%沙黄染液,用火焰加温染色,持续3min,冷却后水洗,待干镜检。结果:菌体呈褐色,荚膜呈黄色,此法主要用于碳疽芽胞杆菌。②Hiss氏硫酸铜法:染液:第一液为结晶紫乙醇饱和液5ml加蒸馏水95ml 的混合液;第二液为20%硫酸铜水溶液。方法:细菌涂片自然干燥,乙醇固定。滴加第一液,微加热染1min。再用第二液将涂片上的染液洗去,勿再水洗,倾去硫酸铜液,以吸水纸吸干镜检。结果:菌体及背景呈紫色,荚膜呈鲜蓝色或不着色。

(4)芽胞染色:染液:第一液为萋-纳氏石炭酸复红液,第二液为95%乙醇,第三液为碱性美蓝液。方法:将已固定的细菌涂片滴加第一液,微加热染5min,冷却后水洗。用第二液脱色2min,水洗。加第三液复染1min,水洗,待干镜检。结果:菌体呈蓝色,芽胞呈红色。
4.负染色法
背景着色而菌体本身不着色的染色为负染色法。最常见的是墨汁负染色法,用来观察真菌及细菌荚膜等。在标本涂片处滴加染液,混合后加上盖玻片(勿产生气泡),轻压。在低倍镜下寻找有荚膜的菌细胞,转高倍镜或油镜确认,如新型隐球菌可见宽厚透亮的荚膜,背景为黑色。
5.荧光染色法
经荧光素染色的细菌,或荧光素标记的荧光抗体与相应抗原的细菌、病毒结合形成的复合物,在荧光显微镜下发出荧光。

微生物培养与分离方法

大多数细菌均可以通过人工方法培养,而衣原体和病毒的分离培养往往需要活组织、鸡胚、特殊细胞株及动物接种。只有将微生物培养出来才能对它进行研究、鉴定和应用。
一、接种与分离方法
根据


责任编辑:Techoo-6
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